מעבדה בנושא שיטות ספירת חיידקים.

* למעבדה זו מצורפים הנספחים הבאים: נספח הרכבי מצעים, טבלתMPN , תרגיל ספירה

מטרות המעבדה:

לימוד שיטות ספירה שונות (רקע, הוראות עבודה, קריאת תוצאות, תרגיל ספירה)

 

 שיטות ספירת חיידקים (רקע)

לספירת חיידקים חשיבות רבה במעקב אחר אוכלוסיות חיידקים במחקר,

לצורכי רפואה ובשמירה על היגיינת מי השתייה והמזון.

במעבדה זו נספור חיידקים הנמצאים בתרחיף נוזלי.

התרחיף מכיל תערובת חיידקים קוליפורמים  (Coliforms).

קבוצת החיידקים הקוליפורמים, מהווים מדד לזיהום מים ומזון בחיידקים ממקור צואתי.

חיידקים אלה הינם אירובים ואירובים פקולטטיביים, גרם שליליים, בעלי צורת מתג, ללא ספורות,

המתסיסים לקטוז עם יצירת גז בתוך 48 שעות ב- 35ºC.

הקבוצה מכילה מגוון מיקרואורגניזמים החיים לרוב במערכת העיכול (מעיים).

הרבה מהם שייכים למשפחת חיידקי האנטרובקטריה. (Enterobacteriaceae).

קבוצת הקוליפורמים כוללת את חיידקי ה- E. coli, (חיידק נפוץ החי במעיים),  Klebsiella pneumoniae (פחות נפוץ במעיים), ועוד.

מציאת חיידקים קוליפורמים במים או במזון, מעידה על זיהום ממקור צואתי, מבני אדם או חיות.

זיהום העלול להכיל חיידקים פתוגנים (גורמי מחלות), (כגון סלמונלה ושיגלה).

פותחו שיטות רבות לספירה, המתאימות למיקרואורגנזימים שונים ולצרכים שונים.

בספירות ישירות. אנו סופרים ישירות את תאי החיידקים, או את המושבות הנוצרות מחיידקים מבודדים על מצע מוצק.

שיטות בהן סופרים מושבות חיידקים נקראות גם שיטות ספירה חיה,

שכן בשיטות אלה סופרים חיידקים חיים בלבד המסוגלים לפתח מושבות.

בספירות עקיפות ניתן לעקוב אחרי מדדים המשתנים ישירות עם העליה במספר החיידקים.

(לדוגמא: עכירות תרבית נוזלית, משקל יבש של מסת התאים, כמות D.N.A. , חלבונים, מעקב אחר תוצרי מטבוליזם ועוד)

 

במעבדה זו נכיר ונבצע את שיטות הספירה הבאות:

ספירות ישירות

1.      ספירה כללית של חיידקים בתא ספירה. (רקע, הוראות עבודה)

2.      ספירה חיה של חיידקים: (רקע)

2.א.              שיטת מקל דריגלסקי (רקע, הוראות עבודה)

2.ב.    

שיטת Pour Plate (רקע, הוראות עבודה)

2.ג.      

שיטת הטיפות (לפי Miles and Misra): (רקע, הוראות עבודה)

ספירות עקיפות (רקע)

3א. הערכת המספר המסתבר ביותר,

(Most Probable Number) (MPN). (רקע, הוראות עבודה, טבלה)

3ב. הכנת עקומת כיול לצורך הערכת מס' חיידקים לפי עכירות. (רקע, הוראות עבודה)

 

1. ספירה אבסולוטית של מספר חיידקים (רקע)

מספר כללי של חיידקים אפשר לספור ישירות  במיקרוסקופ.
בספירה זו נספרים חיידקים מתים וחיים ללא יכולת להבדיל ביניהם.

החיידקים נספרים בתא ספירה בעל נפח קבוע, כגון תא  Petroff-Hausser Mallette((A.H.Thomas, Philadelphia.

בתאי ספירה אלו מסומנות משבצות שלהן נפח קבוע וידוע.

במשבצות אלו נספרים החיידקים תחת המיקרוסקופ ומספרם בתרבית מחושב תוך שימוש בפקטורי המיהול ונפח המשבצות.

 

 

תרחיף החיידקים הנבדק חייב להיות בריכוז 2X107 חיידקים/מ"ל לפחות,

 כדי שנוכל להבחין בחיידקים בתוך הנפח הנבדק.

 

2. ספירה חיה של חיידקים (רקע)

בספירה חיה של חיידקים נספרות למעשה מושבות חיידקים.

ההנחה היא שכל חידק חי, המבודד על מצע מוצק, המאפשר את גידולו, יכול ליצור מושבה.

לכן כדי לקבוע את מספר החיידקים למ"ל בתרחיף,

עלינו לזרוע דגימה על מצע מתאים ולהדגיר בתנאים המתאימים ליצירת מושבות.

מספר המושבות שנקבל יהווה מדד ישיר, למספר החיידקים החיים שהיו בתרחיף ממנו נזרעה הדגימה.

מספר המושבות בצלחת צריך להיות גדול דיו, כדי להוות מדגם סטטיסטי נכון,

אך לא מספר גדול מדי, כדי לא לקבל חפיפה בין המושבות.

מדגם נכון ונוח לספירה נע בין 20-300 מושבות לצלחת.

תרחיף חיידקים הנראה עכור מכיל כ-  108-109 חיידקים/מ"ל ויותר.

לכן יש למהול דגימה מהתרחיף לצורך זריעה בצלחות.

המיהול הנוח ביותר לביצוע, (מבוצע לרוב במספר שלבים), נקרא מיהול עשרוני.

ריכוז החיידקים בתרחיף המקורי מחושב, ע"י הכפלת מספר המושבות שנספרו בצלחת ,

בפקטור המיהול ובפקטור נפח המדגם הנזרע.

 

2א. מקל דריגלסקי (רקע)

בשיטה זו מפזרים נפח קטן (כ-0.1 מ"ל) ממיהול מתאים של תרחיף החיידקים,

על פני צלחת פטרי בעזרת מקל מכופף מזכוכית.

נוזל בנפח גדול יותר לא ייספג באגר ולא יאפשר ספירה נכונה.

חשוב לפזר היטב את התרחיף על מנת לקבל מושבות מבודדות, הנוחות לספירה.

זורעים ממספר מיהולים ובמספר חזרות כדי לקלוע למספר המושבות הנוח והנכון לספירה.

 

2ב.שיטת Pour Plate. (רקע)

בשיטה זו מכינים מראש  מצע עם אגר במבחנות.

כל מבחנה מכילה מצע עם אגר מותך בנפח המתאים לצלחת אחת. (20 מ"ל).

המבחנות נשמרות בטמפרטורה של  50ºC.

מטפטפים נפח ידוע, ממיהול מתאים של תרחיף החיידקים, לצלחת ריקה,

ומעל שופכים את מצע האגר המותך, מערבבים ומקררים. כך ניתן לקבל מושבות בכל נפח מצע האגר .

ניתן לזרוע נפח גדול יותר מתרחיף החיידקים וכן לספור מספר גדול יותר של מושבות בצלחת.

 

2ג. שיטת הטיפות (לפי Miles and Misra) (רקע)

שיטה נוחה ומהירה, להערכת מספר החיידקים, אולם אינה מדוייקת.

בשיטה זו מונחות על גבי צלחת מצע אחת כ- 6 טיפות נפרדות ממיהולים שונים.

נפח כל טיפה קטן (10μl). כך נוכל לקבל, לאחר הדגרה מתאימה, באחת הטיפות,

מספר מושבות קטן מספיק הניתן לספירה.

בצורה זו נוכל להעריך בזריעה בצלחת אחת, מהו ריכוז החיידקים בתרחיף המקורי.

 

ספירות עקיפות (רקע)

בשיטות אלה נמדד מדד עקיף (כימי או פיזיקלי) הקשור בקשר ישיר למטבוליזם החיידקים, או לריכוזם בתרחיף.

 

3א.הערכת המספר המסתבר ביותר (Most Probable number) (MPN).

בשיטה זו נעזרים בשיטות סטטיסטיות  להערכת מספר החיידקים בדגימות מים או חומר מוצק,

תוך שימוש בידע על המטבוליזם שלהם.

אנו נשתמש במצע המתאים לספירת קוליפורמים ו- E. coli במים.

ההנחה היא שכל חיידק שיהיה במצע הנוזלי יתרבה בו.

נצפה במספר תכונות:

א. עכירות הנגרמת מהתרבות  החיידקים במצע. תכונה זו משותפת לכל החיידקים.

ב. פרוק לקטוז בתסיסה חומצית ושחרור גז מימן, תכונה המשותפת לכל הקוליפורמים.

המבחנות מכילות מצע שהסוכר בו הוא לקטוז.
כמו כן מכיל המצע אינדיקטור
BCP ההופך מסגול לצהוב ב-pH חומצי.
ומבחנת הדורהם הפוכה שתאסוף בתוכה את בועות גז המימן הנפלטות.
המימן  נוצר במהלך התסיסה, מפירוק של ח' פורמית לדו-תחמוצת הפחמן + מימן,
בעזרת האנזים פורמאט ליאז.
(דו- תחמוצת הפחמן הוא גז מסיס בנוזל, ולכן לא נראה את הצטברותו במבחנה.)

HCOOHèCO2+H2

ג. פרוק תרכובות β-glucuronides: תכונה האופיינית רק ל E. coli
    במצע נמצא גם החומר:

(MUG) 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide                      .

נבדוק את פירוקו ושחרור methylumbelliferyl שהוא בעל פלואורסנציה בהארה באור אולטרא סגול.
תכונה זו ייחודית לחיידקי
E. coli בלבד.
בעזרת מצע זה וידיעת התכונות שפורטו נוכל לדעת מאותה סדרת מבחנות את מספר הקוליפורמים,

ואת מספר חיידקי E. coli שהיו בתרחיף המקורי.

. הכנת עקומת כיול לצורך הערכת מספר חיידקים לפי עכירות (רקע)

תרחיף חיידקים נוזלי מעל ריכוז מסויים (כ- 107 חיידקים/מ"ל ) הוא עכור.

עכירות זו ניתנת למדידה והיא נמצאת ביחס ישר לריכוז החיידקים, בגבולות מסוימים וידועים.

ניתן להעריך את ריכוז החיידקים בתרחיף נוזלי, על ידי מדידת העכירות שלו.

לשם כך עלינו להכין עקומת כיול, מתרחיף חיידקים שריכוזו ידוע.
(*ריכוז החיידקים יחושב על פי תוצאות הספירה שלכם. בחרו בתוצאה שהתקבלה מספירת החיידקים באחת השיטות והסבירו את בחירתכם).

נמהל מספר מיהולים ונמדוד את העכירות. יש לזכור שכל מין וזן של חיידקים ייתן עקומה שונה.

יש לשמור גם על תנאי גידול זהים ככל הניתן. (מדוע?)

נשתמש בספקטרופוטומטר באורך גל של 600nm שבו אין בליעה לקרקע המזון הצהבהב.

אנו נקרא את העכירות באזור הליניארי (לפי חוק (Beer-Lambert.

אזור הקריאה הלינארי מתאים לגבי תרחיף חיידקים ,עד עכירות מסויימת.

 

הוראות עבודה

·                    נשתמש במספר שיטות ספירה עבור תרחיף חיידקים המכיל חיידקים קוליפורמים. (החיידקים נמצאים בארלנמאייר המסומן "לספירה")

·                    נכין מיהולים בהם נשתמש לכל הספירות.

·                    נשווה את תוצאות הספירה בשיטות השונות.

 

מיהולים עשרוניים

עליכם להכין סדרה בת 11 מבחנות, המכילות 4.5 מ"ל סליין. בעזרת מבחנות אלו נמהל מיהול עשרוני כדלהלן:

  1. הכינו 11 מבחנות עם סליין, בנפח של 4.5 מ"ל.
  2. רישמו על גבי המבחנות את המיהולים (10-1 10-11).
  3. למבחנה הראשונה הוסיפו 0.5 מ"ל מתרחיף החיידקים לספירה.
  4. ערבבו היטב בוורטקס. זהו מיהול 10-1. החליפו את הטיפ.
  5. קחו 0.5 מ"ל מהמבחנה (מיהול 10-1) והוסיפו למבחנה הבאה.
  6. ערבבו היטב בוורטקס. זהו מיהול 10-2. החליפו טיפ.
  7. המשיכו כך עד לסוף שורת המיהולים.

 

1.ספירה בתא ספירה (הוראות)

הכנת התרחיף לספירה בתא תבוצע בידי המדריך.

(התרחיף נמהל פי 2 בחומצת מלח מהולה, כדי להמית את החיידקים,
ולמנוע תנועתם. יש להתחשב בכך בחישוב הסופי.)

  1. ההסתכלות תבוצע בהגדלה X400 במיקרוסקופ.
  2. עליכם לספור חיידקים ב- 5 משבצות קטנות ולעשות ממוצע.

כל חיידק שנספר במשבצת קטנה, (שנפחה 5X10-8  מ"ל), מקביל ל 2X107  חיידקים /מ"ל  בתרחיף הנבדק.

2א.שיטת מקל דריגלסקי (הוראות)

  1. יש לסמן 6 צלחות פטרי עם מצע מזין.
  2. רישמו על תחתית הצלחות בצד את שמכם, את המיהול ממנו זרעתם, ואת נפח הזריעה.
  3. נשתמש במיהולים: 10-5, 10-6, 10-7. מכל מיהול ניקח דופליקטים, (2 חזרות).
  4. קחו נפח של 0.1 מ"ל מהמיהול המתאים והניחו במרכז האגר בצלחת פטרי מסומנת.
  5. טיבלו מקל דריגלסקי בכהל, נערו מעודף הכהל, העבירו באש וחכו לסוף בעירת הכהל.
  6. קררו את המקל בשולי האגר ופזרו את הטיפה תוך סיבוב הצלחת, הניחו את המקל חזרה בכהל.
  7. הדגירו את הצלחות הפוכות ב-ºC 37 ,48 שעות.

 

2ב. שיטת Pour Plate (הוראות)

  1. יש לסמן 7 צלחות פטרי ריקות (שם, מיהול, נפח זריעה).
  2. נזרע מהמיהולים הבאים: ממיהול 10-5, נפח של 0.1 מ"ל בדופליקטים (2 צלחות).
    ממיהול
    10-6, נפחים של 0.1, 0.2, 0.5 מ"ל (3 צלחות)
    ממיהול
    10-7, נפח של 0.5 מ"ל בדופליקטים (2 צלחות)
  3. שיטת הזריעה: בעזרת פיפטור וטיפ המכוונים לנפח המבוקש קחו מהמיהול המתאים,
    והניחו במרכזה של צלחת פטרי ריקה המסומנת בהתאם.
  4. קחו מבחנה עם אגר מותך מאמבט המים החמים. נגבו את המבחנה היטב מהמים,
    ושיפכו על גבי הטיפה.
  5. כסו במכסה וערבבו בעדינות בתנועת 8 כשהצלחת מונחת על השולחן.
  6. חכו להתקררות והתקרשות האגר. הדגירו את הצלחות הפוכות ב37ºC -, 48 שעות.

 

2ג. שיטת הטיפות (Miles and Misra) (הוראות)

  1. סמנו בתחתית צלחת פטרי עם אגר מזין 6 נקודות במרחקים זהים.
  2. בעזרת פיפטור הניחו טיפות בנפח 10µl מהמיהולים הבאים: (מגבוה לנמוך)
     10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4, 10-3סמנו בעזרת חץ את כיוון הזריעה .(ראו איור)
  3. הניחו לטיפות להספג באגר ורק אח"כ היפכו את הצלחת והדגירו ב- 37ºC, 48 שעות.

. הערכת המספר המסתבר ביותר (Most Probable number) (MPN) (הוראות)

  1. לפניך סדרת מבחנות, המכילות מרק EC + MUG (בצבע סגול), ובהן מבחנות דורהם הפוכות.
    המבחנות מסודרות בשלשות. יש לסמן כל שלשה (טריפליקטים )כדלקמן: שם ומיהול מתאים
    מ-
    10-6  ועד .10-11 (סה"כ 6 מיהולים ומכל מיהול 3 חזרות=  18 מבחנות)
  2. בעזרת פיפטור מטפטפים לתוך המבחנות המסומנות, נפח של 1 מ"ל מסדרת המיהולים שהכנתם. (בטריפליקטים)
  3. מדגירים ב- 37ºC, 48 שעות.

. הכנת עקומת כיול לצורך הערכת מס' חיידקים לפי עכירות (הוראות)

יש להכין 6 מבחנות עם מיהולי תרחיף כמוסבר בטבלה:

מס' מבחנה

תרחיף חיידקים

(מ"ל)

מצע סטרילי

(מ"ל)

1

0

5

2

0.5

4.5

3

1

4

4

2

3

5

4

1

6

5

0

 

ערבבו היטב בוורטקס, קחו בעזרת פיפטור 1 מ"ל דגימה לקיווטה מתאימה וקיראו עכירות בספקטרופוטומטר באורך גל 600nm.

תחילה יש לאפס את המכשיר עם מבחנת המצע. (מספר 1).

 

קריאת התוצאות:

  1. לפני המעבדה יש לפתור את תרגיל הספירה, ולהגישו.
  2. יש להכין מראש, טבלאות לרישום התוצאות הגולמיות והמחושבות.
  3. יש להביא למעבדה את טבלת ה-MPN.
  4. בסיום קריאת התוצאות יהיה עליכם להגיש את מספר החיידקים במ"ל תרחיף מקורי,
    מחושב על פי  תוצאות הספירה החיה בעזרת מקל דריגלסקי,
    (בצירוף התוצאות הגולמיות והסבר באילו מן התוצאות השתמשתם)
  5. יש להגיש דו"ח בהתאם להוראות באתר.

הוראות לספירה בצלחות :

  1. סדרו את הצלחות, לכל שיטת ספירה לחוד, לפי המיהולים השונים.
    סיפרו מושבות ורישמו את התוצאות בטבלה.
  2. חשבו את ריכוז החיידקים/מ"ל תרחיף מקורי, לפי כל שיטה בנפרד.
    הסבירו אילו תוצאות נלקחו לצורך החישוב ונמקו.
  3. השוו בין השיטות השונות.

 

הוראות להערכת מספר החיידקים בשיטת MPN

התכונות הנבדקות הן: שינוי צבע המצע לצהוב, בועית גז במבחנת דורהם, ופלואורסנציה באור U.V..

יש לערוך טבלה של תוצאות גולמיות :

מיהול

10-11

10-10

10-9

10-8

10-7

10-6

מספר מבחנות חיוביות להצהבה +גז

 

 

 

 

 

 

מספר מבחנות המראות פלואורסנציה

 

 

 

 

 

 

 

בטבלה יש לציין את מספר המבחנות החיוביות לתכונות הנבדקות בכל מיהול.  

החישוב: מסתכלים בטבלה במיהול הגבוה ביותר, שבו שלושת המבחנות חיוביות לתכונה הנבדקת,

ובהמשך בשני המיהולים הבאים. (הגבוהים יותר)
המספר המתקבל מורכב משלוש ספרות, המייצגות את מספר המבחנות החיוביות, שהיו בכל מיהול.
ועל פיו קובעים את מספר החיידקים בתרחיף המקורי תוך שימוש בטבלה סטטיסטית (
MPN).

(ראה טבלה),

יש להכפיל את המספר המתקבל מהטבלה בגורם המיהול המתאים.(הנמוך מבין 3 המיהולים הנבחרים)
רושמים גם את פקטור הבטחון המתאים.

לדוגמא:

א.         חישוב MPN ע"ס טריפליקטים

מיהול

10-11

10-10

10-9

10-8

10-7

10-6

מס' מבחנות חיוביות להצהבה +גז

0

1

2

3

3

3

 

משתמשים בטבלה בעמודת המספר הסיגניפיקנטי מוצאים את המספר 321

ובהתאמה את המספר המסתבר של המיקרואורגניזמים - 15.0.

כופלים מספר זה בפקטור המיהול הנמוך ביותר בין שלושת המיהולים הנבחרים (החיוביים). (108)

  15*108. ז"א שריכוז החיידקים בתרחיף המקורי היה 1.5*109 חיידקים/מ"ל.

בתחום בטחון של   3.2*108-7*109 חיידקים/מ"ל.

לשם חישוב כמות ה - E. coli בתערובת יש לבדוק בנוסף לגידול וגז גם נוכחות חומר פלוארסצנטי במבחנה בעזרת מנורת u.v

ולחשב MPN לגבי E. coli,בעזרת הטבלאות הסטטיסטיות.

 חזרה לתחילת המסמך